中科院昆明動(dòng)物研究所日前宣布，該所宿兵研究組與中南民族大學(xué)中國(guó)人類腦庫(kù)中心開展合作，利用激光顯微切割和微量樣本RNA測(cè)序技術(shù)，解析了來(lái)源于人腦前扣帶回紡錘形神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄圖譜。該項(xiàng)目得到中科院先導(dǎo)專項(xiàng)和國(guó)家自然科學(xué)基金委重點(diǎn)項(xiàng)目的資助，相關(guān)成果已發(fā)表于國(guó)際知名神經(jīng)生物學(xué)刊物《Cerebral Cortex》上。

項(xiàng)目介紹

研究表明，舊大陸猴、猿類和人類等靈長(zhǎng)類大腦進(jìn)化出一類新的神經(jīng)細(xì)胞，稱為紡錘形神經(jīng)元（VEN），人類大腦中的VEN數(shù)量是最多，但在新大陸猴等更原始的靈長(zhǎng)類中則沒有這類神經(jīng)元存在。神經(jīng)生物學(xué)家猜測(cè)VEN可能參與人類社會(huì)認(rèn)知能力等的高級(jí)認(rèn)知功能，但由于VEN在大腦中分布的局限（僅集中分布于前腦島和前扣帶回兩個(gè)腦區(qū)）以及技術(shù)上的局限性，人們對(duì)VEN的確切功能幾乎一無(wú)所知。因此，構(gòu)建該類細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄圖譜是了解細(xì)胞功能的一個(gè)重要基礎(chǔ)性工作。

宿兵研究組利用激光顯微切割和微量樣本RNA測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)VEN特異表達(dá)升高或降低的基因，并鑒定了4個(gè)新的VEN標(biāo)記基因。對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些基因與VEN的形態(tài)發(fā)育（如樹突分支和髓鞘化等）和功能（如人類社會(huì)情感類疾病等）都密切相關(guān)。人類VEN轉(zhuǎn)錄圖譜的解析，為了解這類在靈長(zhǎng)類大腦進(jìn)化和人類大腦起源中扮演重要角色的神經(jīng)元提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為研究人類神經(jīng)精神疾?。ㄈ缱蚤]癥等）的發(fā)病機(jī)制提供了重要信息。

在這項(xiàng)研究中，激光顯微切割技術(shù)對(duì)分離細(xì)胞、提取RNA起到了重要作用。

激光顯微切割技術(shù)發(fā)展歷程

顯微切割技術(shù)是90年代初發(fā)展起來(lái)的一門新技術(shù)，它能夠從組織切片或細(xì)胞涂片上的任一區(qū)域內(nèi)切割下幾百個(gè)、幾十個(gè)同類細(xì)胞，甚至是單個(gè)細(xì)胞，再進(jìn)行后續(xù)相關(guān)的分子生物學(xué)方面的研究如PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)組學(xué)和其他分析技術(shù)。顯微切割的發(fā)展經(jīng)歷了手動(dòng)直接顯微切割、機(jī)械輔助顯微切割、液壓控制顯微切割和激光顯微切割4個(gè)階段。

激光顯微切割平臺(tái)

1996年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院國(guó)家腫瘤研究所的首次開發(fā)出基于近紅外激光熔膜原理的激光捕獲顯微切割技術(shù)，用于動(dòng)物細(xì)胞的切割和DNA、RNA分析。次年，美國(guó)Arcturus Engineering公司成功研制激光捕獲顯微切割系統(tǒng)，并實(shí)現(xiàn)商品化銷售。又過(guò)了5年之后，激光捕獲顯微切割才在植物研究中成功應(yīng)用，此后這一技術(shù)在生物研究中迅速發(fā)展并被廣泛應(yīng)用。激光顯微切割技術(shù)可將顯微鏡下觀察到的目標(biāo)細(xì)胞直接用激光取出，與早期技術(shù)相比，這種技術(shù)有著快速、簡(jiǎn)單、精確、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、細(xì)胞形態(tài)保持完好、細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)保持完整等優(yōu)點(diǎn)。

激光顯微切割原理

目前激光顯微切割從激光類型和技術(shù)原理上可分為兩種，分別是基于近紅外激光（810nm波長(zhǎng)）的LCM （激光捕獲顯微切割）和基于紫外激光（337～355nm波長(zhǎng)）的LMD（激光顯微切割）兩種。前文所提的紡錘形神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄圖譜項(xiàng)目，采用的就是LCM技術(shù)。

LCM 系統(tǒng)包括倒置顯微鏡、固態(tài)紅外激光二極管、激光控制裝置、控制顯微鏡載物臺(tái)（固定載玻片）的操縱桿、電耦合相機(jī)及彩色顯示器。用于捕獲目標(biāo)細(xì)胞的熱塑膜（乙烯乙酸乙烯酯，EVA）直徑通常為6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰與后繼實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn) 0.5ml離心管相匹配。

LCM技術(shù)的原理是在組織切片上方懸著機(jī)械臂控制的收集管，收集管的塑料帽表面有一層的熱塑膜（其最大吸收峰接近紅外激光波長(zhǎng)），在顯微鏡下選擇好目標(biāo)細(xì)胞后，發(fā)射低能紅外激光脈沖，瞬間升溫使EVA膜融化與目標(biāo)細(xì)胞黏合再迅速凝固。接著目標(biāo)細(xì)胞就粘附在塑料帽表面的EVA膜上并隨著塑料帽一起移走。

機(jī)械臂懸掛控制覆有熱塑膜的塑料帽，放到脫水組織切片上的目標(biāo)部位。顯微鏡直視下選擇目標(biāo)細(xì)胞，發(fā)射激光脈沖，瞬間升溫使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜滲透到切片上極微小的組織間隙中，并在幾毫秒內(nèi)與目標(biāo)細(xì)胞黏合并迅速凝固。激光脈沖通常持續(xù)0.5～5.0毫秒，并且可在整個(gè)塑料帽表面進(jìn)行多次重復(fù)，當(dāng)組織與膜的粘合力超過(guò)了其與載玻片間的粘合力，就可以迅速分離大量的目標(biāo)細(xì)胞。將塑料帽蓋在裝有緩沖液的離心管上，分離的細(xì)胞就轉(zhuǎn)移至離心管中，從而可以分析出目標(biāo)細(xì)胞的分子生物學(xué)特征，用于進(jìn)行后續(xù)研究。

EVA膜約100～200μm厚，能夠吸收激光產(chǎn)生的絕大部分能量，在瞬間將激光束照射區(qū)域的溫度提高到90°C，保持?jǐn)?shù)毫秒后又迅速冷卻，保證了生物大分子不受損害。采用低能量紅外激光的同時(shí)也可避免損傷性光化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。

LCM的優(yōu)點(diǎn)在于快速、簡(jiǎn)單、精確、無(wú)污染，而且適用任何玻片類型，尤其是采用能量較低的近紅外光，不直接接觸樣品，激光發(fā)出的大部分能量都被熱塑膜吸收，對(duì)樣品影響較小。

而LMD技術(shù)則需要將標(biāo)本切片裝片在薄膜載玻片或者薄膜覆蓋的玻璃載玻片上。脈沖紫外激光（UV－A）通過(guò)物鏡聚焦在切片上，沿著目標(biāo)區(qū)域的邊緣移動(dòng)切割，使選擇區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞脫離下來(lái)且周圍組織完好。由于紫外激光的波長(zhǎng)和生物組織的吸收峰非常接近，故常用于切割較厚的樣品組織。

激光顯微切割技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，激光顯微切割技術(shù)較以往的顯微切割技術(shù)有了突破性的進(jìn)展，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、癌癥研究、植物分析、法醫(yī)學(xué)或氣候研究等領(lǐng)域。該方法同時(shí)也適用于細(xì)胞培養(yǎng)的操作或蓋玻片的顯微雕刻。盡管應(yīng)用日趨廣泛，但也有一些問(wèn)題亟待解決，例如設(shè)備成本、進(jìn)行組織切片時(shí)需要通過(guò)固定和染色才能進(jìn)行細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，可能會(huì)影響細(xì)胞的狀態(tài)以及RNA、蛋白質(zhì)的變化等。

目前市場(chǎng)上主要有四家公司提供激光顯微切割的平臺(tái)，分別是美國(guó)賽默飛世爾、德國(guó)徠卡、德國(guó)蔡司和瑞士MMI，而推出世界上第一臺(tái)商用激光捕獲顯微切割系統(tǒng)的Arcturus則于2010年被賽默飛世爾收購(gòu)。賽默飛世爾的旗艦產(chǎn)品ArcturusXT是唯一將基于紅外的LCM和基于紫外的LMD激光切割融為一體的顯微切割儀器，而蔡司、徠卡和MMI都只能使用紫外激光對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行切割和收集。

ArcturusXT激光捕獲顯微切割系統(tǒng)有著開放的平臺(tái)，能夠升級(jí)并擴(kuò)展應(yīng)用以滿足不斷變化的研究需求。例如其開放的顯微鏡接口能讓用戶修改系統(tǒng)，可增加高分辨率的照相機(jī)以獲得更精確的影像。開放的系統(tǒng)設(shè)計(jì)還實(shí)現(xiàn)了載物臺(tái)插板的輕松互換，可容納不同的樣本形式，如神經(jīng)生物學(xué)研究所用的更大玻片。

徠卡提供LMD6500和LMD7000激光顯微切割系統(tǒng)，利用紫外激光分離顯微鏡頭之下的目標(biāo)區(qū)域，并通過(guò)重力這種溫和的方法來(lái)收集樣品。在徠卡的兩款系統(tǒng)中，均使用高精度的光學(xué)組件來(lái)控制激光束移動(dòng)。光束焦點(diǎn)有自動(dòng)修正功能，可在全自動(dòng)模式和交互模式中切換，同時(shí)顯微鏡樣品臺(tái)和樣品本身保持不動(dòng)。通過(guò)這種專利方法，可以達(dá)到超乎想象的精度。

瑞士MMI公司主推CellEctor Plus單細(xì)胞分選系統(tǒng)和CellCut Plus激光顯微切割系統(tǒng)，利用固態(tài)紫外激光對(duì)組織切片等樣本中的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行切割和收集。在整個(gè)分離過(guò)程中，激光都不與需要分離的樣本接觸，對(duì)樣本損傷小，從而保證了樣本RNA的完整性。此系統(tǒng)在樣本收集時(shí)采用PTP（Predefined Target Positioning）技術(shù)，將黏性管蓋劃分成若干區(qū)域，對(duì)組織切片中同種類型細(xì)胞進(jìn)行黏附收集，提高樣品的收集效率，節(jié)省成本；通過(guò)計(jì)量統(tǒng)計(jì)可保證下游的核酸、蛋白實(shí)驗(yàn)有足夠的樣本量。

蔡司的PALM MicroBeam也是利用聚焦激光束來(lái)切割和分離樣本，不過(guò)它收集樣本的方式比較特別。通過(guò)一種激光誘導(dǎo)的壓力波將細(xì)胞彈入管中。MicroBeam的彈射力就好像在您的樣品下方發(fā)生光誘導(dǎo)的微型爆炸，隨之而來(lái)的沖擊波向上推動(dòng)組織。對(duì)于較大的區(qū)域，MicroBeam也可以使用粘性管蓋。